PROCÉDURES DE CONGELATION PROGRAMMÉE avec les appareils CRYOLOGIC

PRÉPARATION DES EMBRYONS - PAILLETTES

c



Paillette classique :
Rincer la paillette de congélation avec la solution de montage sans aller jusqu'au coton
Monter la paillette selon le schéma suivant, en maitrisant la position des embryons vers le bas dans la colonne liquide qui les contient ( à cause du seeding).


c

Paillette Haute sécurité :
La procédure de remplissage est la même mais en utilisant l'embout spéciale qui permet de remplir la paillette sans mouiller la partie à souder.
Souder la paillette côté remplissage, introduire le jonc d'identification puis souder le paillette côté identification.
Remettre ensuite la paillette dans le sens vertical, avant de l'introduire dans le congélateur.

c
Le 20-slot Core est celui qui est utilisé pour les paillettes haute sécurité (avec soudure des embouts)


PRÉPARATION DE CL 8800

a (à faire avant le montage des paillettes)




Mode d'emploi en MODE MANUEL

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1 - Mettre la cryo-chambre dans l'enceinte isolente remplir l'enceinte avec de l'azote liquide.

2 - Selectionner le bon protocole au moyen des poussoir "+" et "-" de l'option "Select" (1)

3 - Allumer l'appareil et mettre le bouton "°C / MN sur la position "°C"

4 - Mettre le bouton (3) sur l'option "HOLD"

5 - appuyer sur le bouton "reset" (2) et attendre que la température de début de protocole soit atteinte.
Sur les appareils les plus récents il faut appuyer 3 foid de suite dans un délai de 6 secondes , il y a alors une validation par bip sonore.

6 - disposer les differents echantillon dans la cryo-chambre.

7 - Appuyer sur "RUN" pour démarrer la procédure.
* - Mettre l'alarme sur "Audible" pour être averti de la phase de "seeding"

7 - Appuyer sur "RUN" pour démarrer la procédure.
* - Mettre l'alarme sur "Audible" pour être averti de la phase de "seeding"

(* - Manoeuvre "Hold- Run" : Quand, en cours du processus on retourne sur l'option (3) "HOLD" le controleur de température maintient la température indiquée
jusqu'à ce qu'on repasse en protocole "RUN". l'appareil reprend ainsi la suite de son programme normalement. Cette manoeuvre peut être intéressante quand il y a un seeding à faire sur de nombreux échantillons.)


Mode d'emploi avec PILOTAGE PAR PC et logiciel « cryogenesis »

c CRYOSTAT a CRYOCHAMBRE

Attention le PC doit être muni d'un haut parleur pour que l'alarme puisse fonctionner : (seeding ou fin de procédure).

- Allumer l’appareil (interrupteur général derrière l’appareil puis vérifier la position des témoins lumineux, comme suit :
Pour les appareils récents "ext" est remplacé par "PC"

 

PREPARATION DU CONGELATEUR CL 3300 et CL 8800 a a
- Remplir le CRYOBATH choisi avec l’azote liquide.

Choix de la CUVE en fonction de son autonomie :
c
Petite : autonomie : 2 h. - grande : autonomie : 4 heures

Descendre doucement LA CRYOCHAMBRE dans l'azote liquide.
En fin d'ébulition, remettre eventuellement de l'azote liquide jusqu'à 1 ou 2 cm du couvercle.
- Ces opérations se font toujours avec le couvercle sur LA CRYOCHAMBRE.

CONFIGURATION

- sur le PC, Appeler le programme « cryogenesis ».
- Remplir les champs, selon votre convenance par exemple :
CLIENT : nom et prénom de madame
FIELD 1 : nom et prénom de monsieur
FIELD 2 : N° d’ordre (de page) dans le cahier de congélation à pages numérotées
NOTE : N° des paillettes, ex : 05001.NOR.01.3 avec :

05……..= année
001……= N° de la page dans le cahier à pages numérotées
NOR.….= 3 premières lettres du nom
01……..= paillette 1 ou 2 ou 3…. Pour la congélation en cours
3…….…= nombre d’embryons dans la paillette

- On peut aussi mettre des informations dans le champ : commentaire.



(case « JOB TYPE » - si utilisée - cliquez sur load, il s’inscrit dans la case « congélation d’embryons »)

case « PROTOCOLE » cliquez sur load et choisir le protocole désiré.

- appuyer sur START JOB (pavé rouge en haut à droite) Attendre que les paillettes soient prêtes et que le congélateur
soit à la température de départ (température ambiante, ou autre)
Une autre fenêtre apparait. en bas de cette fenêtre on peut alors lire la température immédiate.
Quand celle ci est égale à la température programmée, mettre les paillettes dans le bloc de régulation
mettre les paillettes et appuyer sur « RUN »
le programme démarre et on peut suivre l'évolution du refroidissement sur l'écran du PC.

SEEDING :- tremper un écouvillon ou un objet métalique dans l’azote liquide 10 à 15 secondes. Sortir le haut de la paillette
jusqu’au ménisque inférieur de la bulle d’air supérieure.

- Faire le seeding par contact sur la paillette (apparition cristaux à cet endroit) et replonger la aussitôt dans son habitacle.
- valider l’opération sur l’ordinateur. (OK)

Si besoin, Vérifier très rapidement, après 2 minutes, qu’il y a progression de la prise en glace dans la paillette.

Compléter la cuve d’azote jusqu’en haut et laisser le processus se poursuivre, si besoin, jusqu’à la température finale (- 150°C).
quelques minutes Avant d’atteindre la température finale, préparer un récipient contenant de l’azote liquide sur une hauteur
de quelques centimètres et plonger ensuite rapidement la paillette dedans. Après arrêt de l’ébulition de l’azote, stocker la
paillette dans son container définitif.

=> EXEMPLE DE PROTOCOLE - congélation d'embryons :

1 - Température de départ stabilisée : 20 °C
2 - Descente en température à raison de 2°C par minute jusqu'à - 6 ou - 7°C. selon les réactifs utilisés
3 - attendre 5 minutes à la température du seeding (hold)
4 - Déclencher l’ ALARME pour faire le seeding dès que la température est atteinte.
5 - Maintien de la température à - 6 ou -7°C. 9 minutes, après le seeding .
6 - Descente de 0,3°C.par minute jusqu’à – 45°C./-70°C selon votre choix.
8 - puis chutte libre de la température ou Plonger les paillettes , d'un seul coup dans l'azote liquide et laisser les dedans quelques minutes avant de les transférer dans leur lieu de stockage définitif.

cSeeding c Rapport de congélation (CL8800)



c User's guide
Drivers divers Microsoft*, Vista, Xp, W7....

FAIRE UN PROGRAMME PERSONNALISÉ avec CryoGenesis™ Software (CL3300, CL8800)

Les protocoles de température précisent la courbe de congélation pour un échantillon donné.
Ils définissent l’évolution de la température avec le temps pour une opération de congélation et sont
exécutés par le Contrôleur de température afin de régulariser la température à l’intérieur du crysotat.

ALLER DANS L'ECRAN " PROTOCOLE MANAGMENT"

pour créer un nouveau programme on va généralement sur un programme type de la base de données et on le modifie en fonction des besoins. avec les touches : "delete", "insert", "cancel" et "Edit"
Sa sauvegarde (touche "SAVE") se fait en lui attribuant un nom "explicite".

UN PROTOCOLE COMMENCE TOUJOURS PAR L'INDICATION DE LA TEMPÉRATURE DE DÉPART :

Commande "START TEMP"
Cette température est habituellement la température à laquelle on commence la procédure, une fois les paillettes introduits dans la cryochambre. Une fois atteinte, on procédera au lancement du programme en cliquant sur "RUN" de l'écran "JOB-CONTROL"

Commande "RAMP"
Cette commande permet de préciser:
1 : la pente de la courbe (RATE)en °C/mn -> 0.30
2 : la température finale à atteindre pour cette commande (TARGET TEMP.) en °C. -> ex : - 6°C
NB : Cette commande peut être utilisée plusieurs fois pendant un même programme

Commande "HOLD TIME"
Cette commande permet de préciser la période pendant laquelle la dernière température connue doit être maintenue
Cette commande peut être utilisée en fin de programme ou à plusieurs fois pendant un même programme

Commande " FREE FALL"
En fin de programme on peut demander au programmateur :
- de maintenir une température fixe, jusqu'à ce que l'opérateur intervienne manuellement pour plonger les paillettes dans l'azote liquide (HOLD TIME)
Ou de faire une descente en température en chutte libre jusqu'à -120à -150°C., avant d'intervenir manuellement

Commande "BELL & PROMPT"
Cette commande permet de programmer un signal sonore, pour un seeding ou une fin de programme par exemple.
On peut attribuer une information écrite à l'écran qui devra être validé par OK.
NB : Cette commande peut être utilisée plusieurs fois pendant un même programme

a

REGLES A RESPECTER POUR ECRIRE UN PROGRAMME

Les vitesses de descente en température sont lièes à l'inertie de sytème.les tableaux suivants vous donnent les pentes maxima utilisables en fonction du type de CRYOCHAMBRE (VIDE) que vous utilisez.
NB : Les performances sont un peu plus faibles avec une cryochambre pleine de paillettes.
Cryochambre habituellement utilisée pour l'utilisation des paillettes hautes sécurité : réf. Cryologic CC20F

 

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PROCÉDURE DE VITRIFICATION AVEC LE CVM KIT CRYOLOGIC

VOIR LES VIDEOS (Anglais) :Vidéo 1 - Vidéo 2 - Vidéo 3 - Vidéo 4



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